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真菌保藏的基本原理及保藏工艺的要点
      
  真菌研究及其生物工业的发展,必然和安全、长效的保藏技术方法联系,对于有重要经济价值的菌株来说,其保藏技术处理和保藏过程中生理、基因性状的损害、变异,将会带来巨大损失。真菌种类的多样性异常丰富,据估计全世界存在150万种真菌(Hawksworth, 1991),而还不到5%的真菌被描述,只有很少的种类有合适保藏的工艺技术(Ryan,2000),且保藏效果存在菌株水平上的差异性。本文针对近几年真菌保藏领域采取的新技术、原理及适用的保藏研究对象进行了概述。
  1、真菌保藏的基本原理及保藏工艺的要点
  微生物保藏的最终目的是保持菌株的纯度、活性、基因信息的完整性、避免菌株变异和降低退化。多种保藏技术方法适用于真菌的保藏,大体可以分为三类(Smith et al, 2001):
  一是让真菌连续生长的保藏技术。这一类的保藏技术的特点是不断的将菌株移植在新鲜的培养基上,并在合适的条件下生长,随后至于一个低温的环境中,一般是4-10℃,这类保藏技术主要包括斜面移植、油管保藏和蒸馏水保藏等方法。
  二是利用干燥环境保藏菌株的休眠体,如分生孢子、厚垣孢子等,干燥选用的基质可以是空气、硅胶、土壤、沙子等。
  三是利用抑制菌株代谢活性的办法达到长期保藏,一般是通过脱水降低细胞内水分或低温冷冻,在此过程中关键环节是避免和降低冰晶细胞造成的伤害,这类保藏工艺包括冷冻干燥法、低温冻结和液氮保藏法等。
  各种保藏方法优劣比较如下:
  表1 各保藏技术方法的优、缺点及保藏周期(引自Ryan & Smith, 2004)
保藏方法 优点 缺点 保藏周期
斜面移植法 方法直接,花费较少
转接周期短,污染风险
菌株易变异
14d-1年
 
油管保藏法 方法直接,花费较少
菌株退化,污染风险
菌株易变异
-10年
蒸馏水保法 方法直接,花费较少
菌株退化,污染风险
菌株易变异
-10年
沙土管保法 方法直接,花费较少
湿度大时易恶化
保藏内容物太多
-10年
硅胶保藏法 方法直接,花费较少
硅胶有毒性影响
只能保存产孢子的真菌
-25年
冷冻干燥法
长时间保藏
容易储藏及发放
方法复杂,耗时较长,设备较贵,不适用于不产孢的真菌 -50年
低温冻结法
(超低温冰箱保藏)
方法直接
降低菌株变异
设备较贵,必须有电力不间断供应,一些低温保护剂可能对真菌有毒性 -40年
液氮保藏法 适用于大多数真菌,针对不同的属可以最大优化处理,降低菌株变异 设备昂贵,控制降温速率,必须保证液氮的充足供应,降低菌株变异 无限期
 
  注:保藏周期指多数情况,特例除外。
  真菌的长期保藏要保证菌株的生理性状和遗传信息的完整性(Ryan & Smith, 2003),而保藏过程中仅以活性指标判断真菌的是否保藏完好有些片面。Kuhls & Borner (1995) 研究来自不同菌种保藏中心的同一个Trichoderma sp菌株时,再在PCR-指纹检测结果中出现了偏差(Kuhls & Borner , 1995)。Kelly等(1994)将保藏了12年的Fusarium oxysporium f.sp.ciceris 和这一种的其他菌株比较,发现该菌株没有显现出典型的分子指纹特征,证实该菌株已发生退化。Horgen等 (1996) 证实了Agaricus bisporus 的不同传代菌株出现染色体异常和RFLP指纹的多型性。一些没有经过最优化保藏程序的Metarhizium anisopliae 菌株处理,其PCR分子指纹证据显示出了多型性的特征,报道M. anisopliae 菌株经过连续传代培养后,出现“角变”并伴随着一些生理性状的变化(Ryan et al., 2002)。Santors 等(2002) 报道Penicillum expansum 长期保藏后的菌株产棒曲霉素(patulin)和橘霉素(citrinin)的功能受到影响。
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